생물 복잡계에 대한 물리화학 연구 2
박수진, 이남기* | 서울대학교 화학부, namkilee@snu.ac.kr
서 론
단분자 이미징(single-molecule imaging)은 생체 분자의 기능 및 작동 메커니즘을 연구하는 데 있어 매우 유용한 도구이다. 용액에서의 실험이 수많은 분자들의 평균적인 특성만을 도출하는 것과 달리, 단분자 수준에서 생체 분자를 관찰하면 분자들의 여러 상태들을 포착하고, 시간에 따른 상태들의 전이와 분포 변화를 알 수 있다. 단분자 이미징이 제공하는 생체 분자의 이질성(heterogeneity)과 동역학(dynamics)에 대한 정보는 정교한 생체 분자의 작동 메커니즘을 설명하는데 결정적인 실마리를 제공해왔다. 이러한 단분자 이미징 기술은 1990년대, 형광공명전달현상(FRET)을 이용한 단분자 검출이 보고되면서 급진적으로 발전하였다.[참고문헌 1] 광집게(optical tweezer), 전반사 현미경(total internal reflection microscope), 공초점 현미경(confocal microscope), 등 다양한 기술이 개발 및 응용되어 생체 분자의 물리적 특성과 동역학에 대한 연구가 급속도로 발전하게 되었다.[참고문헌 2, 3] 현재 단분자 이미징 기술들은 생체분자 연구에 있어서 필수적인 연구 기술로 자리 매김하고 있다.
그러나 이러한 단분자 기술들은 생체 분자의 정제를 요구하며, 세포 밖에서 이루어진다는 한계를 가지고 있다. 세포내부에는 수많은 생체 분자들이 존재하며, 이들의 복잡한 상호작용에 의해 다양한 생화학 반응들과 세포 내 구조 형성이 일어난다. 이러한 복잡한 현상들을 세포 밖에서 구현하는 것은 매우 어려워 단백질 자체의 기능에 관한 연구가 주로 이루어졌다. 또한, 세포 내의 생체 분자 거동은 세포 밖에서 관찰된 결과와 상이할 가능성도 존재한다. 이러한 이유로 세포 내부에서 일어나는 현상을 직접 이해하는 것은 현대의 생물학 및 의학 분야의 궁극적 목표라 할 수 있다. 이러한 중요성으로 인해 단분자 이미징 기술들은 세포내의 생체 분자 거동을 직접 관찰하는 분야의 발전으로 이어졌다. 2000년대에 최초로 살아 있는 박테리아 세포에서 실시간으로 단일 단백질의 생성을 관찰한 것을 시작으로,[참고문헌 4] 현재까지 많은 세포 내의 생물학적 현상들이 단분자 이미징기술을 통해 규명되었다. 본 총설에서는 단분자 이미징에 의해 가장 활발하게 연구된 생물학적 과정인 박테리아 세포 내 유전자 발현(gene expression)의 동역학에 대한 연구들을 소개할 것이다. 이를 통해 단분자 이미징 기술의 발전 역사와 세포 내 현상을 직접 관측하는 연구 방식의 중요성을 설명하고자 한다.
본 론
1. 살아 있는 박테리아 세포 내 단일 단백질 이미징
형광 단백질이 발견 및 광학적 성질이 개량되면서, 타겟단백질을 형광 단백질로 표지하여 비침습 방법인 형광이미징을 통해 살아 있는 세포 내부의 단백질을 관찰할 수 있게 되었다. 그러나 단일 분자 수준의 단백질을 관찰하는데에는 많은 어려움이 있었다. 세포 내부에 형광 단백질외에도 형광을 방출하는 많은 분자들이 존재하여 세포 자체에서 자동형광(autofluorescence)을 방출하기 때문이다. 세포 내의 단일 단백질을 이미징 하기 위해서는 자동형광과 단일 단백질로부터 방출되는 형광 신호를 구분해 내는 방법이 필요하였다.
2006년, Harvard대의 Sunney Xie 그룹은 살아 있는 대장균 세포 내부에 Tsr이라는 세포막 단백질에 황색 형광단백질 (yellow fluorescent protein, YFP)을 결합시켜 단일 단백질을 이미징 하는 데 성공하였다[그림 1a,b].[참고문헌 4] 세포 내부를 자유롭게 확산하는 세포질 단백질의 경우, 통상적인 이미지 습득 시간 동안(약 100 밀리초) 세포 내부를 빠르게 움직이기 때문에 형광 신호가 자동 형광보다 작게 된다. 반면, 세포막 단백질은 위치가 고정되어 있기 때문에 이미지 습득 시간 동안 형광 신호가 한곳에 누적되어 강한 형광 신호를 검출할 수 있다. 그 결과, [그림 1c]와 같이 자동형광과 단일 단백질의 형광 신호가 뚜렷하게 구분되었다.[참고문헌 5]
이 방법을 이용하여 Xie 그룹은 세포 내부에서 Tsr 세포막단백질이 생성되는 것을 실시간으로 관측하였다[그림 1d].그 결과, 세포 내 단백질 합성은 하나의 mRNA로부터 여러개의 단백질이 합성되는 burst 형태로 일어나며, 한 번의 burst에서 합성되는 단백질의 개수는 기하 분포(geometric distribution)를 따른다는 것을 최초로 규명하였다.
2. 전사 인자(transcription factor) 단백질의 세포 내 확산 규명
전사 인자는 DNA에 결합해서 RNA를 생성하는 RNA 중합효소의 전사(transcription)를 촉진 혹은 억제하여 유전자발현 조절에 핵심적인 역할을 하는 단백질이다. 약 460만개의 염기쌍으로 이루어진 대장균의 긴 염색체에서 전사인자가 어떻게 특정 DNA 서열(약 6-10 염기서열)을 찾아내 결합하는지는 오랫동안 풀리지 않는 난제였다. 세포 밖 실험을 통해 전사 인자가 세포질에서는 비교적 느린 3차원 확산으로 이동하다가, DNA에 결합한 후에는 1차원 확산, 즉, DNA를 따라 미끄러짐 (1D-sliding)을 통해 빠르게 이동하면서 결합 부위를 찾아낸다는 모델이 제시되었다[그림 2a].[참고문헌 6, 7] 그러나, 이러한 현상이 정말로 세포 내에서 일어나는지는 검증되지 않았다. 2007년, Xie 그룹은 살아 있는 대장균 세포 내부에서 lac 오페론의 억제 인자인 LacI 단백질을 단일 분자 수준으로 관찰하였다.[참고문헌 8] 그들은 세포 내에서 매우 적은 수의 황색 형광 단백질이 달린 LacI 단백질을 발현시켰다. 세포 내에 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)가 없는 경우, LacI 단백질이 DNA에 결합한 채로 위치가 고정되어 자동 형광과 구분되는 형광 신호가 검출되었다[그림 2b, 왼쪽]. 반면 IPTG 처리 시, LacI 단백질이 DNA로부터 분리되어 세포질 내부를 자유롭게 확산하기 때문에 이미지에서 희미한 형광 신호만이 나타났다 [그림 2b, 오른쪽]. 이러한 차이를 토대로, Xie 그룹은 세포내 LacI 단백질의 DNA 결합 반응 속도와 확산 계수를 측정할 수 있었다. 더 나아가서, 2012년 Elf 그룹의 후속 연구에서는 LacI 단백질이 DNA에 결합한 후 1차원 확산하는 거리와 그 빈도를 구하였다.[참고문헌 9] 이러한 결과들을 통해 세포내에서 일어나는 LacI 단백질 확산의 동역학을 확인하고, 전사 인자가 DNA에서 빠르게 결합 부위를 찾아내는 기작을 비로소 정확하게 이해할 수 있게 되었다. 이 연구 결과는 세포 밖에서는 구현할 수 없는 실험이라는 점에서, 세포내에서의 연구의 중요성을 잘 보여주는 것이라 평가할 수 있다.
3. 세포 내 리보솜(ribosome) 소단위의 실시간 거동 추적
핵막에 의해 전사와 번역(translation)이 공간적으로 분리된 진핵 생물과 달리, 핵막이 없는 박테리아에서는 전사와
번역이 공간적 분리 없이 일어난다. 때문에 RNA 중합 효소에 의해 mRNA가 합성되는 동시에 리보솜이 붙어 번역을
일으킬 수 있다. 그 결과 전사와 번역의 활성도가 밀접하게 연관되어 박테리아의 유전자 발현 조절의 핵심 기작으로
작용한다. 이러한 특성을 전사-번역 커플링(transcription-translation coupling)이라고 부른다. 그러나 형광 현미경
을 통해 리보솜이 핵상(nucleoid)의 형태로 강하게 응축되어 있는 DNA로부터 배제되어 있음이 관찰되었다[그림 3a].[참고문헌 10] 이에 따라, DNA와 리보솜이 공간적으로 분리되어 있는데 어떻게 전사와 번역이 동시에 일어날 수 있는지 오랫동안 난제로 남아 있다. 2014년 Elf 그룹은 살아 있는 세포에서 단일 리보솜 소단위를 이미징하고, 그 거동을 추적 하였다.[참고문헌 11] 박테리아의 70S 리보솜은 50S 소단위와 30S 소단위가 mRNA에 조립되어 형성된다. Elf 그룹은 세포 내 에서 형광 단백질이 결합된 리보솜 소단위를 발현시켜 단일 리보솜 소단위가 어떻게 이동하는지 이미징 하였다. 그들은 정상적인 환경의 세포와 항생제 처리를 통해 전사를 억제한 세포에서 관찰되는 확산 계수 분포를 비교하였다[그
림 3b]. 전사가 억제된 세포에는 자유롭게 움직이는 리보솜 소단위만이 존재하므로, 이와 비교하여 정상적인 세포의
약 15%의 리보솜 소단위가 자유롭게 움직이는 상태임을 밝혔다. 이때, 나머지 85%의 mRNA 결합 리보솜 소단위들이
핵상과 벗어난 곳에서 관찰되는 것과 달리[그림 3c, 왼쪽], 자유로운 리보솜 소단위들은 핵상으로부터 배제되지 않는
다는 것을 확인하였다[그림 3c, 오른쪽]. 이를 통해 핵상 내부에서 생성되고 있는 mRNA에 리보솜 소단위들이 결합
하여 번역을 시작할 수 있음을 규명하여 전사-번역 커플링의 역설에 대한 한가지 해석을 제공하였다.
4. 유전자 발현에 의한 DNA와 RNA중합 효소의 실시간 운동 규명
전사와 번역이 일어나면 DNA, RNA 중합 효소, 메신저RNA(mRNA), 리보솜이 커다란 복합체를 이루게 되어 구성 생체 분자들의 물리적 특성이 크게 변화한다. 유전자 발현이 진행될 때 동반되는 DNA와 RNA 중합 효소의 물리적 특성 변화는 이들의 세포 내 거동을 바꾸고, 전사 효율에 큰 영향을 줄 수 있다. 이를 규명하기 위해서는 세포 내에서 유전자 발현이 일어나는 동안 DNA와 RNA 중합 효소의 실시간 거동을 관찰해야 한다. 2015년 Achillefs N.Kapanidis 그룹은 살아 있는 세포에서 단일 RNA 중합 효소를 이미징하고, 각 RNA 중합 효소 분자의 거동을 추적하였다[그림 4a].[참고문헌 12] 그 결과 측정된 확산 계수의 분포를 통해, DNA에 결합한 RNA 중합 효소와 자유롭게 확산하고 있는 RNA 중합 효소를 구별할 수 있었다[그림 4b]. 자유롭게 확산하는 RNA 중합 효소의 세포 내 위치는 핵상과 거의 비슷한 반면, DNA에 결합한 RNA 중합 효소는 핵상 표면에 밀집해 있었다[그림 4c]. 이를 통해 유전자 발현에 참여하는 RNA 중합 효소들은 핵상 표면으로 재편성될 수 있음을 제안 하였다.
2019년 본 연구실은 살아 있는 세포에서 특정 유전자의 위치를 이미징하고, 유전자 발현에 의한 DNA 움직임을 실시간으로 관측하였다.[참고문헌 13] lacZ 유전자 아래에 TetR 단백질이 특이적으로 결합하는 유전자 서열을 삽입하고, 세포 내에 황색 형광 단백질이 달린 TetR 단백질을 발현시켜 형광신호로 세포 내 lacZ DNA의 위치를 관측할 수 있었다[그림 5a]. IPTG 처리로 전사가 유도되었을 때, 관측 시간 동안 DNA가 점점 핵상 표면 가까이 이동하는 것을 확인할 수 있었다[그림 5b, 파란색 선]. 반면, lacZ 유전자의 번역이 억제된 돌연변이체에서는 전사 유도 후 DNA의 움직임이 관측되지 않았다[그림 5b, 회색 선]. 즉, 전사 유도에 의한 DNA의 핵상 표면으로의 이동이 번역을 동반할 때 더 크다는 것을 의미한다. 앞서 보고된 RNA 중합 효소 연구에서는 RNA 중합효소의 정적 위치만 확인하였지만, 본 연구에서는 시간에 따라 특정 유전자가 움직이는 것을 직접 규명하였다. 이에 기초하여 박테리아 세포 내 유전자 발현 시스템의 공간적 이동에 대한 새로운 메커니즘을 제시할 수 있었다[그림 5c].
결 론
본 총설에서는 단분자 이미징을 이용해 살아 있는 박테리아 세포 내부의 생체 분자를 직접 관측하고, 이를 통해 유전자 발현 동역학에 대한 이해를 높인 연구들을 소개하였다. 단분자 이미징이 제공하는 세포 내 생체 분자의 상태와 거동에 대한 정보는, 그동안 세포 밖에서 정제된 단백질 및 RNA 등을 이용한 연구로 규명할 수 없었던 복잡한 생명 현상에 대한 새로운 이해를 가능하게 하였다. 현재의 단분자 이미징 기술은 초고해상도로 3차원 수준에서 생체분자의 거동을 어느 정도 추적할 수 있을 만큼 발전하였으며, 박테리아보다 복잡한 시스템을 가진 동물 세포에까지 적용되고 있다. 2014년 노벨화학상이 초고분해능현미경 기술 개발 분야에 수여되었다. 이는 초고분해능현미경을 통해 세포 내의 많은 현상을 규명할 수 있을 것이라는 기대를 반영했다. 그러나, 초고분해능현미경 기술은 정적으로 고분해능 이미지를 얻을 수 있지만, 이것만으로는 세포 내에서 일어나는 복잡한 현상을 실시간으로 규명할 수 없음이 자명해진 현실이다. 최근 알파폴드가 단백질 구조 분야에 혁명적 변화를 가져왔다. 이와 마찬가지로 세포 내에서 단일단백질을 초고분해능, 실시간으로 3차원 운동 관측이 가능한 새로운 기술이 개발된다면, 이미징 분야의 알파폴드와 같이 세포 내 현상을 규명하는데 혁명적 변화를 가져 올 것이다. 이런 기술이 개발된다면, 생화학, 분자 및 세포 생물학, 의학 등 다양한 분야에 커다란 발전을 가져올 뿐 아니라, 각종 질병을 보다 면밀히 이해하고, 이를 치료할 수 있는 각종 신약이 획기적으로 개선될 것이다. 이러한 연구에 분광학에 기반한 다양한 물리화학적 접근법에서 그 해결책이 나올 가능성이 매우 크다고 예상된다.
참고문헌
Ha, T., Th. Enderle,D.F. Ogletree,D.S. Chemla, P. Selvin, and S. Weiss “Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor.” Proc. Natl.Acad. Sci. 1996, 93, 6264.
Neuman, K. C., and Nagy, A. “Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.” Nat. Methods. 2008, 5, 491.
Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., and Ha, T. “Advances in singlemolecule fluorescence methods for molecular biology.” Annu. Rev. Biochem. 2008, 77, 51.
Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., and Xie, X. S. “Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.” Science. 2006, 311, 1600-1603.
Li, G. W., and Xie, X. S. “Central dogma at the single-molecule level in living cells.” Nature. 2011, 475, 308-315.
Riggs, A. D., Bourgeois, S., and Cohn, M. “The lac repressor-operator interaction.3. Kinetic studies.“ J. Mol. Biol. 1970, 53, 401-417.
Gorman, J., and Greene, E. C. “Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA.” Nat. Struct. Mol. Biol. 2008, 15, 768-774.
Elf, J., Li, G. W., & Xie, X. S. “Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell.” Science. 2007, 316, 1191-1194.
Hammar, P., Leroy, P.,Mahmutovic, A.,Marklund, E. G., Berg, O. G., and Elf, J. “The lac repressor displays facilitated diffusion in living cells.” Science. 2012, 336, 1595-1598.
Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., and Weisshaar, J. C. “Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells.” Mol. Microbiol. 2012, 85, 21-38.
Sanamrad, A., Persson, F., Lundius, E. G., Fange, D., Gynnå, A. H., and Elf, J. “Single-particle tracking reveals that free ribosomal subunits are not excluded from the Escherichia coli nucleoid.” Proc. Natl. Acad. Sci. 2014, 111, 11413-11418.
Stracy, M., Lesterlin, C., Garza de Leon, F., Uphoff, S., Zawadzki, P., and Kapanidis, A. N. “Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid.” Proc. Natl. Acad. Sci. 2015, 112, 4390-4399.
Yang, S., Kim, S., Kim, D. K., Jeon An, H., Bae Son, J., Hedén Gynnå, A., and Ki Lee, N. “Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.” Nat. Comm. 2019, 10, 5131.
박 수 진 Soojin Park
• 서울대학교 화학부 학사(2018.8)
• 서울대학교 화학부 석·박사 통합 과정(2018.9-현재, 지도교수 : 이남기)
이 남 기 Nam Ki Lee
• 서울대학교 화학부 학사(1998.2)
• 서울대학교 화학부 석사(2000.2, 지도교수 : 김성근)
• 서울대학교 화학부 박사(2005.8, 지도교수 : 김성근)
• 하버드대 박사 후 연구원(2006.5-2008.12, 지도교수 : X. Sunney Xie)
• POSTECH I-Bio 및 물리학과 조교수 및 부교수(2009.1-2017.2)
• 서울대학교 화학부 부교수 및 교수(2017.3-현재)
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