서 론
본 연구실은 화학생물학(chemical biology)를 선도하 여 연구하는 그룹으로, 화학생물학이란 화학적 백그라운드를 기반으로하여 생물학적 시스템을 이해하는 학문이다.[참고문헌 1] 화학생물학은 생명현상의 이해를 위한 순수 기초과학 분야로 생명현상의 노화, 질병과 관련된 단백질/유전 자 규명 함께 검출한 생체분자를 정량화 하는 부분에 매 우 중요한 역할을 하는 기초과학 분야라고 할 수 있다. 현 재 본 연구실에서는 광가교결합(Photocrosslinking) 기반 단백질 분석, 저분자 형광센서 개발, host-patho- gene 상호작용을 중점적으로 연구하고 있다. 이 중 생체 분자의 변화를 시각적으로 관찰 가능한 형광센서는 특정 분자를 인지했을 경우에만 선택적으로 색 혹은 형광세기의 변화를 신호로 발생하는 물질이다.[참고문헌 2] 지난 10년간 본 연구팀은 저분자 형광화합물 기반으로 다양한 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS) 및 특정 타겟(프로게 스테론, 사이클로옥시게나아제 등) 물집과 결합시 형광변 화를 나타내는 여러가지 형광화학센서를 개발하였다.
형광체의 종류와 형광체 분자 내에 어떤 위치에 어떤 구조의 분자인식 작용기를 도입하느냐에 따라 타깃 분자에 대한 선택성과 형광반응성이 달라진다. 이에 따라 학계에 서는 다양한 합성화학 기법을 활용한 형광 센서 분자들이 연일 보고되고 있다. 특히 이 분야에서는 매우 유사한 분자 구조를 가진 타깃 분자들에 대한 선택성을 어떻게 극대화할 것인가가 여전히 큰 과제로 남아 있다. 단순히 분자인식 구조체만으로는 선택성을 완벽하게 조절하는 데 한계가 있기 때문이다. 이 글에서는 단일 분자의 형광 특성 변화에 의존하지 않고 여러 분자의 자기응집 상태와 특성을 이용한 COX(Cyclooxygenase) 표적 형광분자 센서 개발 전략을 소개하고자 한다.
본 론
1. 저분자 형광 화학센서
형광 화학센서는 특정 타겟에 의해서만 신호변화를 꾀할 수 있는 많은 전략 및 이론이 보고되어 있어 센서의 고안이 비교적 수월하며, 빠른 반응 속도로 인한 빠른 분석 시간, 실시간 변화 확인, 누구나 쉽게 이용할 수 있는 편리성 등의 장점으로 인해 현재는 다양한 물질을 분석 및 이미징하는데 없어서는 안 될 존재가 되었다. 초기의 형광 화학센서는 주로 금속 이온의 검출에 중점을 두었으며, 이는 음이온이나 중성 종보다 물에서 금속 이온의 선택적 결합이 훨씬 쉬웠기 때문이다. 이후, 형광 화학센서 기술의 급속한 발전과 함께 환경적으로 중요한 이온, 음이온, 작은 중성 분자 및 생체 거대분자(단백질 및 DNA 등)를 검출하기 위한 형광 화학센서가 개발되었다.[참고문헌 2]
화학센서는 기본적으로 목표 분석 물질과 상호작용할 수 있는 특정 분자 인식 부위(또는 반응 부위)와, 이 상호작용을 통해 발광 신호 변화를 유도할 수 있는 구조로 구성된다. 분석 물질과 상호작용하는 반응 부위는 크게 두 가지 전략으로 설계될 수 있다. 첫 번째는 초분자(Supramol- ecule)를 활용하여 가역적으로 결합하는 방식이고, 두 번째는 화학 반응을 이용한 비가역적 방법이 있다.[참고문헌 3] 초분자를 활용한 결합 전략은 분자 인식 부위가 분석 물질과 비공 유결합을 통해 상호작용하는 것에 기반을 둔다[그림 1a]. 비공유결합은 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 수소 결합, 그리고 pi-pi stacking등의 화학적 상호작용을 통해 발생할 수 있고, 이러한 상호작용은 가역적이기 때문에 분석 물질의 위치 변화와 양의 변화를 실시간으로 관 찰할 수 있다는 장점이 있다. 하지만, 유사한 분자 구조를 가진 물질에 대한 선택성이 떨어지고 주변 환경의 영향을 많이 받기 때문에, 복잡한 생체 내 환경에서 활용하는 데는 한계가 있다. 이 계열의 형광프로브는 분자 수준의 미세환경에 따라 형광 신호가 변화하는 특성을 갖고 있어서, 타겟물질과 결합 전 후 분자환경의 변화를 형광신호로 생성하는 매커니즘을 갖고 있다. 그리고 분자인지구조체 외에도 분석물질과 특이적으로 비가역 화학반응을 일으키는 작용기를 활용하여 센서개발에 이용할 수 있는데, chemodosimeter라고도 불리며, 분석 물질과 화학 반응 을 할 수 있는 특정 작용기를 포함하고 있는 것이 특징이 다[그림 1b].[참고문헌 4] 이와 같은 프로브는 화학 반응을 이용하기 때문에 비가역적이며, 따라서 분석 물질의 동적 변화를 연구하기보다는 해당 물질의 활성도와 양을 확인하는 데 더 적합하다. 이러한 chemodosimeter는 분석 물질과의 반응을 기반으로 하기 때문에, 반응성에 따라 선택적인 프로브를 개발할 수 있으며, 비공유결합으로는 특정하기 어려운 반응성이 큰 활성 카보닐 종(Reactive Carbonyl Species, RCS)나 효소와 같은 물질도 탐지가 가능하다. 과거 이같은 단일 분자를 인지하는 화학센서가 분자인식(molecular recognition)메커니즘 연구에만 집중적으로 사용되어 왔지만, 생명과학 연구자들이 영상화 하려는 타겟이 균일한 단일 분자의 영역을 넘어서게 되면서 화학 센서의 타겟은 비약적으로 넓어지고 있는 추세이다. 본 연 구팀은 각종 질병으로 인해 세포 내 활성산소종에 대한 항상성이 변화한다는 점에 착안하여 생체내 활성산소와 관련된 분자들을 형광탐지 할 수 있는 기술을 개발하여 특정 질병 모델에서 발생되는 활성산소 종 및 그 대사체들을 선택적으로 탐지하는 기술을 개발하는 연구를 수행하였다.[참고문헌 5] 또한, PG-1이라는 형광체가 나노응집구조를 이루고 프로게스테론 분자와 상호작용할 때 나노응집구조의 크기가 수십에서 수백 나노미터로 변화하며 형광변화를 보인다는 흥미로운 현상을 관찰해 보고한 바 있다.[참고문헌 6] 단일 분자 수준에서 분자인식 형태와 형광을 조절하던 것에서 나아가 분자들의 응집구조 변화로 생분자의 동적 변화를 관측 가능하다는 사실은 합성화학자들의 화학물질공간(chemical space)을 더욱 넓히는 결과를 가져왔다. 연구팀은 이러한 연구경험 및 데이터를 바탕으로 육종암(Sar- coma) 조직 모니터링 할 수 있는 센서개발에 적용하기로 하였다.[참고문헌 7]
2. 연부조직육종 조직 이미징을 위한 바이오마커
연부조직육종(Soft Tissue Sarcoma)은 전체 성인의 악성 종양 중 1%를 차지하는 희귀 암종으로, 근육, 지방, 신경, 섬유조직 등 다양한 조직에서 발생하는 악성 종양을 통칭한다.8 미국에서는 매년 약 15,000명의 새로운 환자 가 발생하며, 평균 생존율은 약 18개월로 보고되었다. 생존율이 낮은 이유로는 초기 단계에서 증상이 거의 없어 조기 진단이 어려운 점과 다양한 아형으로 인한 진단 정확도 가 낮기 때문이다. 따라서 본 연구팀은 육종암의 초기진단 및 모니터링이 가능한 센서를 개발하는 것을 목표로 하고 연구를 시작하였다. 진단 정확도가 낮은 이유는 기존 암 줄기세포 마커(ALDH-1, CD44, CD133)가 육종암의 악성 종양에서 과도하게 발현되는 경우가 많아 육종 세포 집 단 내 암 줄기 세포의 식별 및 분리를 복잡하게 때문인데,[참고문헌 9] 육종의 암 줄기 세포 집단을 시각화하기 위한 대체 전략 및 바이오마커 발굴이 필요했다.
처음 우리의 가설은‘육종암 줄기 세포에 특이적인 마커가 존재한다면, 이 마커가 기존의 바이오마커와 상호작용 하지 않을까? ’였다. 연구팀은 몇 가지 레퍼런스를 바탕으로 암 줄기 세포의 가장 잘 특성화된 바이오마커인 CD44 와 프로스타글란딘 경로에 주목했다. 다른 암 유형의 암줄 기세포에서 CD44가 프로스타글란딘 경로를 매개하고 CD44가 프로스타글란딘 경로와 상호작용하여 암 줄기 세포의 유지와 관련이 있다는 보고가 있으며,[참고문헌 10] 최근 임상 육종 샘플에 대한 유전체 프로파일링을 진행한 유전자 온톨 로지 분석결과는 프로스타글란딘 경로 신호가 통계적 특이성을 가지는 것으로 나타났다.[참고문헌 11] 또한, 프로스타글란딘 경로의 효소 중 사이클로옥시게나제 (COX)는 종양 진행과 치료 저항성을 촉진하는 것과 관련이 있으며, 여러 연구에서 COX 아이소타입 중 하나인 COX-2가 다양한 암 유형의 비줄기 암 세포에 비해 암 줄기 세포에서 과발현된 다고 보고되었다.[참고문헌 12] 이러한 보고를 바탕으로, 연구팀은 육 종 조직의 CSC를 시각화하기 위해 COX-2를 타겟으로 하는 형광 이미징 에이전트를 설계하기로 결정하였다.
3. COX-2 타겟 형광 화학센서 설계
현재까지 세포 내 COX-2 타겟 이미징을 위한 다양한 화합물들이 설계되었다. 이들은 3가지 전략을 구현하였 는데, 첫 번째 전략은 로다민(Rhodamine) 또는 퀴놀리늄(Quinolinium)같은 비반응성 형광체와 결합된 COX- 2 리간드를 사용하여 세포 내 COX-2의 상대적 발현을 영상화하였다[그림 2a].[참고문헌 13] 그러나 이러한 방법의 프로브는 형광체의 방출 신호가 지속적으로 활성화되어 있기 때문에 배경 신호 간섭에 취약했다. 두 번째는 COX-2와 화학 센서 간의 분자 상호작용을 광유도 전자 이동(Photoin- duced Electron Transfer, PET) 기반으로 영상화하는 전략으로[그림 2b],[참고문헌 14] 이러한 화학센서들은 체외 또는 배양된 세포와 같은 모델 시스템에서 신호 대 배경비가 개선되었지만, 생물학적 시스템의 복잡성으로 인해 분자의 구조적 변화가 쉽게 변할 수 있다. 세 번째 접근법은 효소 반응 시 발광 생성물을 선택적으로 생성하는 기질을 설계하여 효소 활성을 영상화하는 방법이 있다[그림 2c].[참고문헌 15] 활성 기반 감지는 유용한 기술이지만, 대부분의 인간 조직 샘플이 고정된 후 검사되므로 임상 병리학 샘플에는 적용하기 어려운 한계를 가진다. 따라서 연구팀은 target to background signal ratio를 높일 수 있으며, 구조적 안 정성을 가진 자기 응집 해제 유도 발광(disaggregation induced emission)을 이용한 전략이 조직 및 세포 영상 화에 유용할 수 있을 것으로 보았다.
본 연구팀은 센서개발을 위한 형광체로 BODIPY를 선택하였다. 그 이유는 높은 형광 효율, 광안정성, 화합물의 구조 변형의 용이함, 좋은 세포 투과성을 가지고 있으며 BODIPY 분자내 파이파이 스태킹(pi-pi stacking)으로 인해, 수용액에서 저희가 생각한 응집에 유리한 형광체이기 때문이다.[참고문헌 16] 그리고 COX-2 리간드로서, 인도메타신 (Indomethacin)을 선택했는데, 이는 Christina Woo 그 룹에서 진행한 프로테오믹 연구에서 COX-2 리간드들 (Indomethacin, Celecoxib, Naproxen) 중 인도메타신이 오프 타겟의 수가 가장 적게 도출되었다.[참고문헌 17] 이로 인해 이미징 시에 낮은 형광 백그라운드 시그널을 기대했다. 최종적으로 메소 위치의 파라-페닐기와 베타-2 위치에 인 도메타신을 도입하여 두 가지 BODIPY 결합체(BD- IMC1, BD-IMC-2)를 개발했다[그림 3].
4. 살아있는 세포 및 조직에서 활용
화합물을 합성한 후, 알부민, 콜라겐, IgG 등과 같은 풍부한 효소(Abundant enzyme)을 포함한 다양한 생체분자(Various biomolecules), 20가지 아미노산(20 amino acid), 다양한 pH 조건, 조직 차단 용액(Tissue blocking solution) 및 세포 배지(Cell media)까지 조직에서 응집에 방해가 될 수 있는 물질들에 대한 선택성 결과, BD- IMC 화합물이 COX에서만 높은 선택성을 보이는 것을 확인하였다. 비록 BD-IMC가 COX-1과 COX-2 사이의 아이소타입 선택성이 부족하지만, 일반적으로 인체내에서 homogeneous한 COX-1과는 다르게 COX-2만이 유도 가능한 COX 형태인 만큼 조직에서 COX-2 발현 변화에 따른 반응을 제공할 것으로 예상했다.
다음으로 입자의 크기를 측정할 수 있는 동적 광산란 (dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 프로브와 단백질 그리고 혼합물의 사이즈 변화를 분석한 결과, BD- IMC-1 및 BD-IMC-2의 입자 크기는 각각 620.4 nm 및 598.5 nm이며, COX-1 또는 COX-2와 반응한 BD- IMC-1의 입자 크기는 각각 122.8 nm 및 128 nm로 감소하고, COX-1 또는 COX-2와 반응한 BD-IMC-2의 입자 크기는 각각 96.8 nm 및 87.74 nm로 감소하는 것을 확인하였다[그림 4a]. 이는 수용액에서 프로브가 응집 된 구조를 형성했다는 것과 타겟단백질과 결합하면서 응 집이 해제되는 것을 보여주었다. 두 나노구조 모두 COX 결합에 의해 10분 이내에 확연하게 응집 해제되었고, 몇 시간 동안 지속되어 COX 아이소타입에 관계없이 크기가 5분의 1 이하로 감소하였다. 이러한 체외 형광 반응 및 DLS 분석 결과는 우리의 BD-IMC 프로브가 응집 해제 메커니즘을 통해 작동하며 COX-1 및 COX-2 모두에 대 한 형광 활성화를 이끈다는 것을 증명하였다.
COX 선택성을 확인하고 COX와 프로브 간의 상호작 용을 조사한 후, 연구팀은 이 화학센서의 생물학적 조건에서의 활용 가능성을 조사했다. 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)는 인터루킨-6(IL-6)과 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)와 같은 사이토카인의 발현을 촉진하여 염증 반응을 활성화하는 것으로 알려져 있다.[참고문헌 18] 이 염증 활성화 경로에서 COX-2는 세포 내 프로스타글 란딘 합성을 위한 주요 조절자이자 트리거로, LPS 자극에 의해 그 표현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 세포에 LPS를 먼저 처리하고, BD-IMC로 살아있는 세포를 형광 이미징한 결과, HeLa, RAW264.7 및 인간 육종에서 유 래한 Saos-LM2 세포 모두 LPS를 처리하지 않은 세포 대비하여 통계적으로 유의미한 형광 턴온 반응을 보였다 [그림 4b]. 마지막으로, 연구팀은 BD-IMC 화합물을 사 용하여 육종 조직에서 COX-2 이미징을 수행했다. 환자 들의 육종 조직에서 형광 공초점 현미경(Fluorescence confocal microscopy) 이미지는 단일 이미지에서 여러 COX-2 양성 세포를 보여주었고, 이 세포들은 BD-IMC- 1과 BD-IMC-2 프로브에 의해 강하게 염색되었다[그림4c]. COX-2 항체로 염색한 이미지와 비교해 보았을 때, 높은 공동 위치 상관성을 보이며 개선된 조직 이미징을 얻 을 수 있었다. 이는 육종 조직 내 암 줄기세포를 시각화할 수 있는 새로운 접근 방식을 제시한 결과이다. 또한, 단일 분자의 형광 특성 변화에 의존하지 않고 여러 분자의 자기 응집 상태와 특성을 이용한 것이라, 생체시료처럼 복잡한 시료 상에서도 효과적으로 작동할 수 있다는 것을 보여주었다.
결 론
지금까지 자기응집 특성을 이용한 COX 표적 형광센서 개발에 대해 서술하였다. 기존에는 COX 효소를 표적하는 이미징 분자가 단분자 수준에서 형광 특성의 변화를 통해 COX 효소를 영상화하는 방식이 주로 사용되었으나, 이번 연구에서는 형광체 다중복합체의 나노구조 변화에 따른 형 광 특성을 이용하여 고정화된 임상 시료에서 표적 단백질을 이미징하는 방법을 학계 최초로 보고하였다. 이는 고정된 조직이 병리학적 샘플로 가장 널리 사용된다는 점을 감 안할 때, 응집해재 유도센서(disaggregation induced sensor)의 임상적 응용 가능성을 제시하였다.
다양한 분석물을 탐지하기 위해 타겟 특이적이며 높은 안정성과 효율을 지닌 화학센서 개발하는 것은 화학생물학 자들의 오랜 목표이다. 그들의 노력으로 지난 수십 년 동안 많은 센서들이 개발되었고, 이는 화학, 생물학, 약물학, 생 리학, 환경 화학 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 그럼에도 불구하고, 여전히 높은 선택성, 감도, 그리고 정확한 신호 변화를 유도할 수 있는 정밀한 발광 탐침의 개발이 필요하며, 이는 해결해야 할 중요한 과제로 남겨졌다. 이를 위해 새로운 발광 단위와 타겟 물질 간의 상호작용에 대한 연구는 끊임없이 진행되고 있으며, 이러한 연구자들의 노력의결과로 임상적으로 적용 가능한 화학센서들이 더욱 많이 개발되기를 기대한다.
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이 준 석 Jun-Seok Lee
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• 뉴욕대학교(NYU) 화학과, 박사(2007.3 - 2013. 8 지도교수: 장영태)
• 한국과학기술연구원, 연구원/선임연구원/책임연구원(2010- 2020)
• 고려대학교 의과대학 약리학교실 부교수(2022.3 - 현재)
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