테트라진 클릭 반응:화학생물학적 도구 개발 및 최신 연구 동향(2025년 11월호)

洪均梁
2일 전
7분 분량

최종 수정일: 8시간 전

박준영, 박종민* | 강원대학교 화학과 부교수, jpark@kangwon.ac.kr

서 론

2001년 처음 제안된 클릭 화학(click chemistry)은 물에 서도 매우 선택적인 결합을 가능하게 하여, 화학 및 생명과 학 연구 전반에 큰 혁신을 불러일으켰다.[참고문헌 1]대표적인 클릭 반응으로는 구리(I) 촉매 아자이드-알카인 고리화 첨가 반응 (Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition, CuAAC), 변형-촉진 아자이드-알카인 고리화 첨가 반응 (Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition, SPAAC), 그리고 역-전자요구 디엘스-알더 반응(Inverse-Electron- Demand Diels-Alder, IEDDA) 등이 있다.[참고문헌 2] 이들 반응은 높은 수율과 선택성을 제공하며, 생리적 조건에서도 비특이적 교란을 최소화할 수 있어 오늘날 생체직교화학(bioorthog- onal chemistry)의 근간을 이루고 있다.

이 가운데 테트라진(tetrazine)을 기반으로 한 IEDDA 반응은 반응 속도가 빠르고 금속 촉매를 필요로 하지 않기 때문에 특히 주목을 받아왔다. 고리 내에 포함된 4개의 질소 원자에 의해 전자가 부족한 테트라진은 다이엔 친화체(dienophile)와의 빠르고 선택적인 상호작용을 가능하게 하며, 이는 기존 CuAAC나 SPAAC보다도 우수한 반응성을 보인다. 이러한 특성 덕분에 테트라진 클릭 반응은 세포 이미징(cellular imaging), 진단(diagnostics), 약물 전달(drug delivery) 등 다양한 화학생물학적 응용에서 핵심 도구로 자리 잡았다.[참고문헌 3] 이 글에서는 테트라진을 기반으로 한 IEDDA 반응의 특성과 장점을 바탕으로, 다양한 화학생물학 분야에서의 최신 연구 동향과 주요 사례를 소개하고자 한다.

본 론

1. 단백질 표지와 세포 이미징

세포는 다양한 생체분자의 정교한 상호작용을 통해 생명 현상을 유지하는 복합적 시스템이다. 이 가운데 단백질은 촉매 작용, 구조 형성, 신호 전달 등 세포 내 주요 기능을 수 행하는 핵심적 거대 분자로서, 세포 소기관 내에 특이적으로 분포하거나 세포 내의 신호 네트워크를 연결한다. 따라서 이러한 단백질의 활동을 모니터링하는 것은 세포의 복잡한 생리 및 병리 현상을 분자 수준에서 이해하기 위해 필수적이다. 이를 위한 접근법 가운데 하나가 세포 이미징이며, 현재 가장 널리 활용되는 기술 중 하나로 자리매김하고 있다.[참고문헌 4]

세포 이미징에서 특정 단백질을 구별하기 위해 가장 먼저 시도된 접근은 형광 단백질(fluorescent protein)을 유전 자 수준에서 융합 발현시키는 방식이었다.[참고문헌 5] 이후에는 HaloTag, SNAPTag과 같이 효소적·화학적 반응을 통해 형광 분자를 도입할 수 있는 표식(tag) 시스템이 개발되었다.[참고문헌 6, 7] 이러한 전략들은 단백질 위치와 발현 양상을 직접 추적할 수 있는 강력한 도구였으나, 단백질 크기 증가로 인한 구조적 간섭이나 본래 기능 저해 가능성이 꾸준히 지적되어 왔다.[참고문헌 8] 또한 특정 단백질의 결합 분자(ligand)에 형광 물 질을 연결한 형광 프로브(probe)를 개발하는 연구도 개발 되어왔으나 프로브의 큰 크기 때문에 세포 내에 들어가기 어렵거나 단백질 표지 능력에 한계가 존재하여 새로운 방법의 개발이 요구되어져 왔다. 이러한 기존의 접근방식의 한계를 보완하기 위하여 클릭 화학을 이용한 단백질 표지 방법이 제안되었으며, 특히 테트라진을 이용한 IEDDA 반응은 빠른 반응 속도와 높은 특이성으로 인해 단백질 표지 및 세포 이미징 분야에서 유용성이 입증되고 있다.[참고문헌 9]

테트라진을 이용한 세포 이미징 전략 중 가장 널리 활용 되는 방법은 선표적화(pre-targeting) 접근법이다[그림 1A]. 이 방법의 핵심은 표적화 과정과 이미징 과정의 두 단계로 분리하는 데 있다. 먼저, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자나 항체에 반응성 작용기를 도입하여 세포에 처리한다. 이후 이 결합 분자가 표적 부위에 충분히 축적되고, 결합하지 않은 잔여 화합물이 제거될 때까지 기다린 뒤, 형광체와 연결된 테트라진을 주입하여 빠르고 선택적인 ‘클릭’ 반응을 통해 표적을 시각화 한다. 이러한 시간차 기반 전략은 분자량이 커서 체내 제거가 느린 항체와 같은 결합 분자에 직접 형광체를 부착한 형광 프로브를 사용했을때 발생하는 높은 배경 신호(background signal) 문제를 극복할 수 있으며, 결과적으로 신호 대 잡음비(signal-to- noise ratio)가 월등히 높은 선명한 이미지를 제공한다.[참고문헌 10] 이러한 테트라진을 이용한 세포 이미징은 2008년 Hilder- brand 그룹에 의해 처음으로 보고되었다[그림 1B].[참고문헌 11]이들은 HER2/neu 항체에 노보넨(norbornene)을 도입하고, 형광체가 결합된 테트라진과의 IEDDA 반응을 통해 살아있 는 세포에서 표적 단백질을 성공적으로 이미징하였다.

전자가 부족한 테트라진은 형광 분자와 인접할 경우 광 유도 전자 전달(photoinduced electron transfer, PET) 이나 전하 이동(charge transfer) 과정을 통해 형광이 소광(quenching)될 수 있다. 그러나 다이엔 친화체와의 클릭 반응을 통해 새로운 6각 고리가 형성되면 이러한 소광 효과가 사라지면서 형광이 다시 발현된다. 이 원리를 활용하면 클릭 반응이 일어난 위치에서만 형광이 켜지도록 설계할 수 있어 민감하고 정밀한 형광 바이오 이미징이 가능하다. 2010년 Weissleder 그룹이 테트라진과 결합된 보디피(BODIPY) 화합물을 이용하여 클릭 반응 이후 형광이 발현되는 최초의 테트라진 기반 turn-on 프로브를 보고하였으며, 이후 이러한 방식은 바이오이미징에 널리 응용되고 있다[그림 1C].[참고문헌 9]최근 Wu 그룹은 아이소나이트릴(isoni-trile)과 테트라진 간 [4+1] 사이클로첨가(cycloaddition) 반응을 활용하여 turn-on 형광 프로브를 개발하였다.[참고문헌 12] [그림 1D] 이 반응은 IEDDA 반응과 마찬가지로 테트라진 기반 클릭 반응의 한 종류이지만, IEDDA 반응과 달리 5원 고리를 형성하면서 반응이 진행된다.[참고문헌 13] 연구진은 아이소나이 트릴과의 클릭 반응 이후 형광분자 내에 필수적인 피라졸(pyrazole)이 형성되게 함으로써 세포 내 원하는 부위에 형 광체를 형성하는 전략(in situ fluorophore formation)을 도입하였다. 이를 통해 목표 단백질과 세포 소기관의 바이 오 이미징이 가능하였으며, 다른 클릭 화학 반응과 병용함 으로써 살아있는 세포 내에서 서로 다른 목표를 동시에 이미징 할 수 있다는 것을 보여주었다. 2025년에는 Jäschke 그룹은 디플루오로보론(difluoroboron)을 결합한 새로운 형광성 테트라진 유도체를 개발하였다.[참고문헌 14] 이 화합물은 테트라진의 소광 특성을 활용하여 클릭 반응 전에는 형광이 억제되어 있으나, IEDDA 반응을 거치면서 새로운 difluoroboron 기반 형광체가 형성되면서 강한 신호를 발현하여 기존 프로브 대비 향상된 감도와 안정성을 보여주었다. 또한 자극 방출 억제 초해상도 형광 현미경(Stimulated Emission Depletion, STED)을 이용한 초고해상도 이미징에도 성공적으로 적용되어 나노미터 스케일에서 세포 구조 관찰을 가능하게 하였다.

2. 테트라진 기반 영상 진단

최근 테트라진 기반 클릭 반응은 세포 내에서 형광 이미징(fluorescence imaging)하는 것을 넘어 생체내에서 단백질, 핵산, 소기관 등 다양한 생체 표적을 실시간으로 추적하는 연구에 적용되고 있다. 특히 질병 진단 분야에서도 주목받고 있다. 테트라진은 양전자 방출 단층촬영(Positron Emission Tomography, PET)이나 자기공명 영상(Magnetic Resonance Imaging, MRI)과 같은 분자 이미징(Molecular imaging) 기술에 적용하기 위해 활발 하게 연구되고 있다[그림 2A].

양전자 방출 단층촬영은 방사성 동위원소가 표지 된 분자를 체내에 주입한 뒤, 방출된 양전자를 검출하여 생체 내 분자의 분포와 대사 과정을 실시간으로 추적하는 분자 이미징 기술이다. 기존 전략은 구리 촉매나 유기주석 전구체의 사용으로 인한 세포 독성과 안정성 문제를 내포하고 있었다. 이러한 한계를 극복하기 위해 테트라진 기반 클릭 화학이 각광받고 있으며, 예를 들어 방사성 동위원소가 표지된 다이엔 친화체과 테트라진을 선택적으로 결합하도록 설계하면 살아있는 세포나 동물 모델 내에서 특정 단백질이나 조직을 높은 특이성과 해상도로 추적할 수 있다. 테트라진은 양전자 방출 단층촬영에 2013년 처음 도입되었다.[참고문헌 15] 해당 연구는 항체에 결합한 trans-cyclooctene(TCO) 과 64Cu로 표지된 테트라진(64Cu-Tz-Bn-NOTA)을 이 용하여 수행되었다. 쥐를 대상으로 한 실험에서 높은 종양 대 배경 비율로 종양을 명확하게 구분할 수 있었으며, 클릭 반응 이후 반응하지 않고 남아 있는 64Cu-Tz-Bn- NOTA는 신속하게 몸 밖으로 배출됨에 따라 기존 방법의 문제점이었던 상대적으로 긴 반감기로 인한 표적이 아닌 장기에 대한 손상을 줄일 수 있음을 보여주었다. 근래에는 이 기술이 진단의 영역을 넘어서 치료까지 확장되고 있다. 기존에 사용되는 방사선 의약품은 진단과 치료를 동시에 수행하기에는 어려움이 있다. 이러한 한계를 해결하고자 Zhang 그룹은 테트라진 기반의 선표적화와 신호 증폭을 결합한 3단계 방사성 치료진단(radiotheranostic) 전략을 제안하였다[그림 2B].[참고문헌 16] 먼저 전립선 특이 막 항원 (prostate-specific membrane antigen, PSMA) 결합 분자에 테트라진을 접합한 뒤 방사선 동위원소 68Ga로 표지한 [68Ga]Ga-PSMA-Tz를 이용해 PET 이미징을 수행하고, 종양을 전표적화하였다. 이후 TCO로 변형된 Pd@Au 나노플레이트를 주입하여 종양 내 신호를 증폭시켰으며, 마지막으로 177Lu으로 표지한 테트라진 화합물 ([177Lu]Lu-PSMA-Tz)를 처리하여 종양 내 축적과 체내 잔류 시간을 증가시킴으로써 치료 효과를 강화할 수 있음을 보여주었다.

MRI는 뇌 구조와 병변을 고해상도로 이미징 할 수 있는 강력한 도구이지만, 뇌 내 분자 수준의 표적을 선택적으로 추적하는 데에는 한계가 있다.[참고문헌 17] 특히, 혈액-뇌 장벽 (Blood–Brain Barrier, BBB)으로 인해 많은 조영제가 뇌 조직에 도달하지 못하며, 기존 조영제는 표적 특이성이 낮고 민감도가 제한적이다. 이에 따라, BBB를 효율적으로 통과하면서도 높은 민감도와 선택성을 갖춘 새로운 MRI 조영제 개발이 요구된다. 2025년 Long 그룹은 란타니드- 테트라진 프로브(Lanthanide–tetrazine probe)를 개발하였다[그림 2C].[참고문헌 18] 이 화합물은 란타니드(Lanthanide)의 신호 방출 능력과 테트라진의 생체 직교 클릭 화학 특성을 결합하여, 뇌 질환 진단을 위한 BBB 투과 전략에 활용될 수 있도록 설계되었다. 다이엔 친화체로는 cyclic-RGD 펩타이드(cyclic-RGD peptide, cRGD)와 결합된 노보넨을 사용하였으며, cRGD-노보넨은 BBB를 통과하여 뇌에 특이적으로 축적이 되는 것으로 알려져 있다.[참고문헌 19] cRGD- 노보넨과 란타니드-테트라진 프로브의 클릭 반응으로 형성된 프로브는 기존 조영제 대비 약 2배 증가한 신호 증강 효율(relaxivity)을 나타내었다. 또한 이 화합물들은 in vitro 세포 독성 테스트에서 낮은 독성을 나타냈으며, 세포 이미징에도 성공적으로 적용되었다. 추가적으로 Eu 및 Tb 복합체에서는 테트라진 감광을 통한 인광(phospho- rescence)이 관찰되었으며, 이는 해당 물질이 MRI-광학 다중영상 프로브로 활용될 수 있음을 시사한다. 이러한 다기능성은 해당 프로브가 뇌 질환 진단을 위한 차세대 조영 제로서 개발 가능성이 있음을 보여주었다.

3. 테트라진과 단백질내 친핵체간의 반응성

앞서 살펴본 바와 같이, 테트라진을 이용한 화학생물학 적 응용은 세포 이미징, 진단, 치료 등 다양한 영역으로 빠르게 확장되어 왔다. 이러한 연구의 확산에 따라 생체내에서 효율적인 클릭 반응을 수행하기 위해서 테트라진의 생체직교성(bioorthogonality) 자체에 대한 연구 필요성이 대두되고 있다. 실제로 일부 유도체를 생리학적 환경에 두고 관찰했을 때 시간이 지남에 따라 점진적으로 분해 되는 양상을 보였으며,[참고문헌 19, 20] 강염기 조건에서 고리 열림 반응을 겪는 사례가 일부 연구에서 관찰된 바 있다.

테트라진의 반응성에 대한 초기 연구는 1982년 Setiz 그룹에서 이루어졌다. 이들은 전자 끄는 작용을 하는 카보닐기(carbonyl)와 결합한 테트라진이 아민(amine)이나 싸이올(thiol)과 반응할 수 있음을 보여주었다.[참고문헌 21] 이후 1985년 Neilson 그룹은 전자 끄는 작용이 없는 테트라진도 강염기 수산화포타슘(KOH)과 반응하여 고리 열림 (ring opening reaction)반응이 일어날 수 있음을 보고 하였으며,[참고문헌 22] 이 밖에도, 강염기 조건에서 2-아릴아세토니 트릴(2-arylacetonitrile)이나 피라졸론(pyrazolone)에 의해 테트라진 고리가 열리는 사례가 확인되었다.[참고문헌 23, 24] 또한 실제 테트라진을 이용하여 단백질 표지를 수행할 경우, 테트라진의 구조에 따라 배경 신호가 나타날 수 있음도 관 찰되었다.[참고문헌 25, 26] 이러한 다양한 불안정성 및 부반응 사례가 있음에도 불구하고, 테트라진의 생체직교성에 대한 체계적이고 정량적인 평가는 상대적으로 부족하였다. 이런 연구의 필요성에 따라 우리 연구실에서는 테트라진의 생체 직교성을 정밀하게 검증하였고, 그 결과를 최근 ACS Central Science에 보고하였다.[참고문헌 27]

본 연구에서 우리는 ‘단백질의 기본 단위인 아미노산 중 일부는친핵체로 작용할 수 있으며, 이런 아미노산들이 테트라진과 반응할 수 있다’ 라는 가설을 세워 연구를 진행 했다. 우선 실제 단백질에 테트라진을 처리했을 때 비특이적 신호가 나타나는지 조사하였다. 그 결과 단순한 비특이적 흡착으로 설명하기 어려운 수준으로 단백질과 테트라진이 반응하는 결과가 관측되었으며, 이는 화학적 결합에 기인한 현상일 가능성을 시사했다. 이를 뒷받침하기 위해 단순 친핵체 모델로서 디에틸아민(diethylamine) 및 에탄티올(thioethanol)을 선택하여 테트라진과 반응시켰고, 생성물을 분리한 뒤 질량분석(Mass Spectrometry,MS)과 핵자기공명분광분석(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)을 통해 생성되는 화합물의 구조를 규명하였다. 이 결과 테트라진이 실제로 단백질의 아민이나 싸이올 계열의 친핵체와 직접 반응할 수 있음을 명확히 확인할 수 있었다[그림 3A].

이러한 관찰을 기반으로, 우리는 단백질의 친핵체와 반응성이 낮고 생체직교성이 높은 새로운 테트라진을 개발하기 위하여 전자적·입체적 환경이 다른 테트라진 유도체 23종을 합성하고 형광 화합물과 연결하였다. 23종 의 테트라진과 세포의 단백질과의 반응성을 정량적으로 비교한 결과 테트라진의 구조에 따라 단백질과의 반응성 이 큰 차이를 보였다[그림 3B]. 단백질과 반응성을 보이 는 대부분의 테트라진 유도체들은 농도 의존적으로 단백 질과 반응하였다. 또한 단백질 내 친핵체들을 말레이마 이드(maleimide) 또는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester)로 처리해 반응성을 차단했을 때 테트라진과 반응이 크게 감소하는 것을 확인하였다. 이는 단백질에 존재하는 친핵성 잔기와 테 트라진이 직접 반응한다는 가설을 다시 한번 뒷받침해주는 결과였다.

이러한 테트라진의 비특이적 단백질 반응성이 실제 단백질 표지 및 세포 이미징에서 문제를 일으킬 수 있는지를 검증하기 위해 브루톤 티로신 키나아제(Bruton’s tyrosine kinase, BTK)를 형광 이미징 하는 실험을 진행하였다. 이를 위해 이브르티닙(ibrutinib)에 TCO를 연결한 BTK 프로브를 합성하여 세포에 처리하였다[그림 4A]. 이 후 23종의 테트라진 형광 물질을 처리하여 BTK를 이미징한 본 결과 단백질과의 테트라진의 비특이적 상호작용으로 인해 목표한 단백질뿐 아니라 다양한 단백질이 형광으로 표지되는 현상을 관찰하였다[그림 4B]. 이러한 현상 은 테트라진의 구조에 따라 다르게 나타났으며 일부 테트라진 유도체만이 표적 단백질인 BTK를 선택적으로 표지 할 수 있었다. 앞선 연구결과를 바탕으로 이러한 현상은 테트라진 구조에 따른 단백질과의 반응성 차이와 연관이 있음을 알 수 있었다. 즉, 단백질과의 반응성이 낮은 테트라진 유도체들이 BTK를 선택적으로 이미징 할 수 있음을 알 수 있었다. 이어서 우리가 새로 합성한 테트라진 유도 체들 중 세포 형광 이미징에서도 성공적으로 BTK 단백질을 이미징 할 수 있는 화합물이 있는지 평가하였다. 이를 위해 BTK 면역형광염색(immunofluorescence)과 BTK 프로브-테트라진 형광 클릭 반응 기반 형광 이미징 간의 상관관계를 확인한 결과, 대부분의 테트라진 유도체는 낮은 상관계수를 보였으나, SiR-Tz20만이 높은 상관관계를 보여주었다. 이 결과를 통해 우리는 SiR-Tz20이 가장 생체직교적인 테트라진 유도체임을 알 수 있었다[그림 4C]. 이러한 결과는 다른 단백질(XPO1)이나 세포 소기관(미토 콘드리아) 이미징 실험에 SiR-Tz20을 이용했을 때도 동일하게 나타났다. 이를 통해 우리가 찾아낸 가장 생체직교성이 높은 SiR-Tz20의 우수성을 입증할 수 있었다.

마지막으로 동물 모델 실험에서 SiR-Tz20의 활용 가능성을 살펴 보았다[그림 5A]. 마우스 비장에서 존재하는 면역 세포 중에 B세포에만 많은 양의 BTK 단백질이 존재하므로 BTK 염색을 통한 B 세포 염색이 가능한지 실험해 보았다. 앞선 실험에서 사용하였던 BTK 프로브와 SiR-Tz20을 이용하여 마우스의 비장 세포들을 형광 염색해본 결과 기존에 널리 사용되고 있던 테트라진 유도체인 SiR- Tz1과는 달리 SiR-Tz20은 성공적으로 B 세포만을 이미징 할 수 있음을 알 수 있었다[그림 5B]. 이러한 결과는 새로 개발된 SiR-Tz20이 기존의 테트라진에 비해 더 정밀한 생체직교성을 보이고 이는 세포 및 동물 모델 실험에 성공적으로 적용할 수 있음을 의미한다. 따라서 테트라진을 이용한 다양한 세포 이미징, 진단, 치료등 다양한 분야 에 보다 정교한 도구를 제공할 수 있음을 제시하였다.

결 론

테트라진을 이용한 클릭 화학은 단백질 표지 및 생체 영상 분야의 혁신을 이끌었으며, 세포 내 형광 이미징을 넘어 PET, MRI 등 분자 영상 기술에 활용되어 생체 내(in vivo) 진단 및 치료 영역으로 빠르게 확장되고 있다.

하지만 테트라진을 이용한 화학생물학적 응용이 확대됨 에 따라, 효율적인 클릭 반응 수행을 위해 테트라진의 생체 직교성 자체에 대한 체계적인 연구 필요성이 대두되었다. 일부 연구에서는 테트라진 유도체가 생리학적 환경에서 분해되거나 강염기 조건에서 고리 열림 반응을 겪는 사례가 관찰되었으며, 실제 단백질 표지 실험 시 배경 신호가 발생 하는 불안정성이 지적되기도 하였다.

최근 연구를 통해 테트라진이 단백질을 구성하는 친핵체 역할을 하는 아미노산 잔기, 특히 아민이나 싸이올 계열의 친핵체와 직접 반응할 수 있음이 명확히 확인되었다. 이러한 비특이적 반응은 표적 단백질뿐 아니라 다양한 단백질과 반응할 수 있는 문제를 야기하며, 실제 형광 세포 이미징에서 표적 단백질의 선택적 표지를 방해하여 정밀한 단백질 형광 이미징 연구에 있어서 테트라진 기반 프로브의 신뢰성을 저해할 수 있음이 검증되었다.

그동안 많은 연구를 통해 테트라진 기반 클릭 화학은 생체 영상과 분자 진단 분야에 지대한 공헌을 해왔다. 하지만 그 유용성을 극대화하기 위해서는 비특이적 반응을 효과적으로 극복한 SiR-Tz20 유도체의 사례에서 볼 수 있듯이, 테트라진 유도체의 전자적·입체적 환경을 정밀하게 조절해야 한다. 이는 높은 특이성과 향상된 생체직교성을 갖는 새로운 테트라진 유도체를 개발하는 것이 향후 연구의 핵심 과제임을 시사한다. 이러한 연구를 통해 궁극적으로 테트라진 기반 기술은 살아있는 생체 시스템에서 더 정확하고 민감한 분자 수준의 정보를 제공하는 핵심적인 도구로 자리매김할 것이다.

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