단분자 형광 공명 에너지 전달 기술을 활용한생체분자의 구조 및 동역학 연구(2026년 2월호)

洪均梁
1일 전
4분 분량

지상민, 고혜란* | 중앙대학교 화학과 부교수, hrkoh@cau.ac.kr

서 론

생체분자는 고유한 3차원 구조를 기반으로 기능을 수행하며, 구조 변화는 기능 상실뿐 아니라 효소 활성, 신호전달, 단백질 상호작용 등 생체 내 조절 메커니즘 전반에 직접적인 영향을 미친다. 따라서 구조 변화의 정밀한 이해는 질병의 작동 원리와 세포 시스템의 동적 조절 과정을 규명하는 데 필수적이다. 그러나 대부분의 생체분자는 수 나노미터 크기이며, 전이 상태나 반응중간체처럼 매우 짧은 시간 동안만 존재하는 구조는 기존의 결정학, NMR, Cryo-EM 등과 같은 정적 구조 분석 기법만으로는 충분히 포착하기 어렵다. 생체 원자힘현미경(Bio-AFM)과 같이 동적 관찰이 가능한 기술도 존재하지만, 공간 분해능의 한계로 인해 고해상도 구조 규명에는 제약이 따른다.[참고문헌 1]

이러한 상보적 한계를 극복하기 위한 접근으로 단분자 형광 공명 에너지 전달(single-molecule Fluorescence Res-onance Energy Transfer, smFRET) 기술이 널리 활용되고 있다. smFRET은 1–10 nm 범위의 거리 변화를 높은 민감도로 감지할 수 있으며, 밀리초 이하의 시간 분해능으로 단일 분자의 구조 전환, 이질성, 전이 상태 및 중간체 분포 등을 직접 관찰할 수 있다. 이러한 특성은 고해상도 구조 분석 기법과 동적 관찰 기법 사이의 간극을 효과적으로 메우며, 복잡 한 생체분자의 작동 메커니즘을 규명하는데 큰 장점을 제공한다.[참고문헌 2]

정확한 거리 측정은 smFRET 기반 구조 연구의 핵심 요소이며, 이를 위해 실험적, 분석적 기법이 개발되어 왔다. 본 글에서는 먼저 smFRET의 역사적 발전 과정과 기술적 배경을 살펴본 뒤, 정밀한 거리 변화 측정을 가능하게 하는 주요 실험적, 분석적 전략들을 종합적으로 논의하고, 향후 연구 방향을 제시하고자 한다.

본 론

1. FRET에서 smFRET까지

FRET은 10 nm 이내에 존재하는 두 형광체 사이의 쌍 극자-쌍극자 공명 상호작용(dipole-dipole resonance interaction)에 의한 에너지 전달 현상으로 1948년 Förster에 의해 이론적으로 정립되었다[그림 1A].[참고문헌 3] 이러한 에너지 전달의 정도(FRET 효율, E )는 두 형광체 사이의 거리의 여섯 제곱에 반비례하기 때문에, FRET 효율은 분자간 거리 변화를 민감하게 반영하는 대표적인 나노스케일 거리 측정 도구로 자리잡았다[그림 1B]. 1967년에 Stryer와 Haugland는 poly-L-Proline 올리고머를 이용해 주개 (donor)-받개(acceptor) 사이의 거리를 정밀하게 조절한 실험을 통해 Förster의 이론을 검증하였고, 이때 처음으로 FRET을 분광자(spectroscopic ruler)라는 용어로 지칭 하였다.[참고문헌 4] 이 시기를 기점으로 앙상블 수준에서의 FRET은 단백질 접힘, 단백질-핵산 상호 작용 등 다양한 생화학 연구에서 핵심적인 도구로 널리 활용되기 시작하였다. 이후 레이저 광원과 고감도 광검출기가 큰 폭으로 발전하면서 FRET 실험의 정확성과 적용 범위가 크게 확대되었는데, 1980년대 후반부터 1990년대 초반에 이르러 단일 형광 분자를 실험적으로 검출한 연구들이 보고되었다.[참고문헌 5-7] 이러한 기술적 성숙을 바탕으로 1996년에 단분자 수준에서의 FRET을 측정할 수 있는 smFRET 기법이 처음 보고되었는 데, 이는 주개-받개 형광 분자 쌍을 개별 분자 수준에서 관측함으로써, 기존 앙상블 측정에서는 평균화되어 관찰할 수 없었던 분자의 동적 구조 변화, 전이 상태, 일시적 중간체, 복합체 형성 및 해리 과정을 실시간으로 추적할 수 있음을 보여준 획기적 진전이었다.[참고문헌 8] 현재 smFRET은 단백질 접힘 및 해리, 효소 반응 메커니즘, DNA/RNA의 구조 변 동성, 뉴클레오솜 및 염색질 리모델링, 세포 내 단분자 수준 상호작용, 단백질 복합체의 구조 및 기능 분석 등 다양 한 생체 분자 연구 분야에 폭넓게 활용되고 있다.

2. 정확한 FRET 효율 측정을 위한 실험적 전략 1: 형광 신호 보정

정확한 FRET 효율을 얻기 위해서는 주개와 받개의 형광 신호를 정확하게 구분하고 보정하는 과정이 필수적이다. [그림 2A]는 대표적인 형광체 쌍인 Cy3(주개)와 Cy5 (받개)의 흡수 및 방출 스펙트럼을 나타낸 것으로, Cy3의 방출 스펙트럼 일부가 Cy5의 방출 스펙트럼과 중첩됨을 확인할 수 있다. 이러한 스펙트럼의 중첩은 FRET 효율 계산 시 형광 세기의 혼재를 유발하며, 이는 받개 형광체의 직접 여기 또는 파장 분리 과정에서 발생하는 형광 신호 누출(leakage)에 의해 더욱 복잡해진다[그림 2A, a-c]. 따라서 정확한 FRET 효율 측정을 위해서는 이러한 신호 혼재 요인을 정량적으로 보정하여 주개 및 받개의 순수 형광 세기를 산출해야 하며, 이를 통해 겉보기 FRET 효율(E_app, apparent E )을 계산할 수 있다.

하지만 동일한 형광체 쌍을 사용하더라도 실험 환경과 광학 장비의 특성에 따라 FRET 효율이 다르게 나타날 수 있다. 이러한 차이는 주로 주개와 받개 형광체의 양자수율(quantum yield) 차이와 검출기의 파장 별 검출 효율 차이에 기인한다. 양자수율은 흡수된 광자 중 형광으로 방출되는 비율을 의미하며, 형광체의 종류뿐 아니라 pH, 온도, 형광체 주변 환경 등에 따라 달라질 수 있다. 검출 효율은 시료에서 방출된 광자 중 실제 검출기에서 검출되는 광자의 비율로, 광학 부품 및 검출기의 파장 감도에 의해 결정된다. 이와 같은 불균형은 감마 계수(gamma factor, γ)를 이용해 보정할 수 있으며, smFRET 실험 방식에 따라 다양한 방법으로 감마 계수를 구할 수 있다. 예를 들어, 전반사 형광 현미경을 이용한 smFRET에서 감마 계수는 주개와 받개 형광체의 형광 세기를 실시간으로 측정한 뒤, 받개 형광체가 광표백(photobleaching) 되는 순간의 주개 와 받개의 형광 세기 변화량 비를 이용해 구할 수 있다[그림 2B]. 이렇게 구한 감마 계수를 적용하면 보다 정확한 FRET 효율을 얻을 수 있고, 실제 형광체 간의 거리도 더 신뢰성 있게 반영된다[그림 2B]. 실제로 동일한 시료에 대한 대규모 블라인드 테스트 연구에서 연구실마다 보정 인자는 다르게 나타났으나, 적절한 보정 이후에는 형광체 간 거리 측정의 정확도가 5Å 이하로 나오는 것을 확인할 수 있었다.[참고문헌 9] 이는 구조 분석을 위한 FRET 기반 거리 측정에서 신호 보정 과정이 얼마나 중요한지를 보여준다.

또한, 많은 생체분자 상호작용 연구는 정제된 시료를 사용한 시험관 내(in vitro) 환경에서 수행되지만, 실제 생체 분자들은 훨씬 복잡한 세포 내 환경에서 작동한다. 이러한 차이에도 불구하고, 앞서 소개한 신호 보정 전략을 적용하면 살아 있는 세포 내에서도 FRET을 활용한 단백질-단백질 상호작용의 정량 측정이 가능하며, 실제로 대장균 세포내 단백질 상호작용을 성공적으로 측정한 사례가 보고되었다[그림 3A]. 기존 in vitro 실험으로 포착하기 어려운 상호작용을 재현성 있게 정량화 할 수 있었다는 점에서 의미가 크다.[참고문헌 10]

3. 정확한 FRET 효율 측정을 위한 실험적 전략 2: 형광 수명 기반 측정

앞서 서술한 FRET 효율 측정은 형광 세기 기반 분석에 의존한다. 그러나 형광 세기는 여기광의 세기, 시료 두께, 파장별 검출 효율 등과 같은 다양한 외부 요인의 영향을 크게 받기 때문에, 정확한 FRET 효율을 얻기 위해서는 복잡한 보정 과정이 필수적이다. 반면, 형광 수명은 이러한 외부적 요인에 거의 영향을 받지 않으므로, 형광 수명을 기반으로 FRET 효율을 측정할 수 있으면 복잡한 환경에서도 별도의 보정 없이 정확한 FRET 효율을 얻을 수 있다. 이를 가능하게 하는 기술이 형광 수명 이미징 현미경(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM)으로, 형광체가 여기된 후 바닥상태로 돌아오기까지의 형광 수명을 측정한다. 주개에서 받개로 에너지 전달이 일어나면 주개의 형광 수명은 짧아지므로, FRET 효율은 이 러한 형광 수명의 변화에 직접적으로 반영된다. 이 때문에 형광 수명 기반 FRET 측정은 형광 세기 기반 측정보다 더 안정적이고 재현성 있는 결과를 제공한다. FLIM-FRET은 세포 및 조직 수준에서 특히 유용하며, 자가 형광이 강하거나 두꺼운 생체 조직에서도 외부 요인에 영향을 덜 받기 때문에 신뢰도 높은 정량 분석이 가능하다[그림 3B]. 이와 같은 장점을 활용하여, 살아있는 세포 내에서 단백질의 안정성 변화 및 회전율을 실시간으로 관측한 사례도 보고되었다.[참고문헌 11] 이러한 연구들은 형광 수명 기반 측정 이 복잡한 생체 환경에서 정확한 FRET 효율을 얻는 강력한 실험 전략임을 보여준다. 그러나 FLIM-FRET에도 한계가 존재한다. 형광 수명 측정을 위해서는 많은 수의 광자를 필요로 하기 때문에 시간 분해능이 낮아 빠른 동역학을 관찰하기 어렵다. 또한 수명 분석에서는 고가의 장비가 필수적이며, 일부 형광체는 비정형적인 수명 거동을 보이기도 하여 분석 난이도가 높아질 수 있다. 종합하면, 형광 수명 기반 FRET 측정은 복잡한 생체 환경에서도 높은 정밀도와 재현성을 제공하는 강력한 전략이지만, 장비적 부담과 시간 분해능의 한계도 함께 고려해야 한다.

4. 정확한 FRET 효율 측정을 위한 분석적 전략

정확한 FRET 효율을 얻기 위해서는 실험적 정밀도뿐 아니라 신뢰도 높은 분석 기법이 필수적이다. 용액 상에서 자유 확산하는 분자의 smFRET 데이터는 거리 정보와 구조 상태의 분포를 제공하지만, 기존 분석 방식은 임의적 임계값 설정이나 잡음 제거 과정에서 사용자 편향이 개입되기 쉬워 복잡한 시스템에서는 부정확성을 초래할 수 있다. 이를 보완하기 위한 대표적 방법으로 베이지안 추론(Bayesian inference) 기반 분석이 개발되었다. 이 접근법은 임의의 형광 임계값을 활용한 데이터의 선별이나 FRET 히스토그램의 적합(fitting) 과정을 거치지 않고도 다양한 데이터와 파라미터에 대한 분석을 동시에 할 수 있어, 잡음이 많은 데이터에서도 안정적인 분석이 가능하다.[참고문헌 12] 또한 최대가능도(maximum likelihood) 기반 방법도 활용할 수 있는데, 최대가능도 측정 방법이란, 특정 모델에서 실험 데이터가 관측될 확률이 가장 높아지도록 하는 파라미터 값을 추정하는 방식이다. 초기에는 분자의 확산 또는 구조 변화 중 단일 요인만 고려하는 단순 모델이 주로 쓰였으나, 최근에는 확산 시간, 형광체의 밝기, 구조별 FRET 효율, 구조 전환 속도 등 여러 요인을 통합적으로 반영하는 모델이 개발되어 분석의 적용 범위가 크게 확 장되었다.[참고문헌 13]

하지만 위와 같은 모델 기반의 추론 방식은 물리적 또는 통계적 모델을 구축하고, 그 모델에 데이터를 맞추는 방식으로 분석되기 때문에, 데이터가 복잡해지고 고려되어야 하는 파라미터의 수가 증가할수록 모델 설정은 까다로워지고, 분석의 정확성과 계산 효율 또한 크게 저하되는 한계를 가진다. 이러한 문제를 극복하기 위해 데이터 기반 접근이 도입되었으며, 최근에는 딥러닝 기반의 데이터 분석 도구들이 개발되어 smFRET 데이터를 자동으로 분류하고 주요 신호를 신뢰성 있게 분석하는 것이 가능해졌다. 이는 잡음이 많거나 변동성이 큰 데이터에서도 높은 안정성을 보여주며, 분석 자동화 측면에서도 높은 활용 가치를 지닌다[그림 4].[참고문헌 14, 15]

결론적으로, 정확한 FRET 효율 측정을 위해서는 모델 기반 추론과 데이터 기반 자동 분석을 상호 보완적으로 활용하여 사용자 편향을 최소화하고, 복잡한 생체분자 시스 템에서도 신뢰도 높은 구조 동역학 정보를 도출하는 전략 이 필수적이다.

결 론

본 글에서는 동적 상태에서 생체분자의 구조와 작동 메커니즘을 규명하기 위한 핵심 도구로서 smFRET 기술을 소개하였다. 생체분자의 기능을 이해하기 위해서는 반응 과정에서 나타나는 다양한 구조적 상태와 그 전환 과정을 정밀하게 파악하는 것이 필수적인데, smFRET을 이용하면 기존의 앙상블 측정으로는 관찰하기 어려웠던 짧은 생존 시간의 전이 상태 및 중간체를 직접 관찰할 수 있다. 이러한 동적 구조 정보를 신뢰성 있게 얻기 위해서는 정확한 FRET 효율 측정이 필수적이며, 이를 위해 정교한 신호 보정 과정과 적절한 분석 기법이 요구된다. 실제로 실험적 신호 보정 절차를 적용함으로써, 동일 시료에 대해 서로 다른 측정 조건에서도 높은 정밀도로 일관된 결과를 도출할 수 있음을 확인할 수 있었다.[참고문헌 9] 또한, 신호 변동성이 크고 잡음이 많은 데이터의 정량 분석을 가능하게 하는 분석 기술 역시 지속적으로 발전하고 있다. 특히 최근 주목받는 딥러닝 기반 자동 분석 기술은 분석 시간을 획기적으로 단축함과 동시에, 검증된 학습 데이터 기반으로 높은 정확도를 보여 주고 있다는 것도 보고되었다.[참고문헌 14, 15] 향후에는 이러한 AI 기반 분석 기술이 더욱 정교화되어 실시간 데이터 해석, 상태 전환 예측, 복잡한 동역학 모델 추정까지 통합적으로 수행함으로써 smFRET 연구의 정량성과 재현성을 크게 향상 시킬 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 흐름은 구조 변화를 중심으로 하는 다양한 생체분자 연구 분야에서 smFRET 기술의 활용 가치를 더욱 높일 수 있는 중요한 기반이 될 것이다.

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