정유경, 배상수 | 서울대학교 의과대학, sbae7@snu.ac.kr
서 론
'콩 심은데 콩나고, 팥 심은데 팥난다’는 우리나라 속담과 같이, 모든 생명체의 삶, 노화, 죽음 등과 같은 큰 운명은 어느 정도 설계되어있다. 생명체의 가장 기본 단위인 세포 안에는 DNA라는 고분자물질의 설계도가 있는데, 생명체는 이러한 DNA 염기서열에 담겨져 있는 정보를 통해 삶을 영위해 가고, 또 그 정보를 DNA 형태로 후손들에게 물려준다.
그렇다면, DNA에 담겨있는 유전정보는 어떻게 발현될까? 이에 대한 연구는 지난 1953년 제임스 왓슨과 프랜시스 크릭이 DNA 구조를 처음으로 밝히면서 본격화되었다. DNA는 이중가닥이 서로 상보적으로 결합되어 나선형 형태로 존재한다. 보통 DNA는 상당히 안정된 형태의 이중나선 구조로 존재하지만, 필요할 경우 DNA 이중가닥이 일시적으로 풀리면서 단일가닥인 RNA를 마구마구 복사해 낸다. 이는 오목볼록한 판에서 판화를 찍어내는 것과 같이, 세포 내에서는 DNA에 담겨져 있는 염기서열 정보와 꼭 닮은 수백, 수천개의 RNA들이 만들어 진다. 그리고 이러한 RNA 정보를 기반으로 단백질, 효소와 같은 필수물질들이 세포 내에서 합성된다.
만약, DNA 염기서열 정보가 잘못되면 어떤 일이 생길까? 판에 담긴 정보가 잘못되어 있다면 그 판에서 찍어낸 모든 판화들의 정보가 잘못되어 있는 것과 같이, DNA 유전자 정보가 잘못되어 있으면 해당 단백질에서의 아미노산 서열에도 오류가 발생한다. 물론, 운이 좋게도 그 잘못된 아미노산이 단백질의 구조를 만들거나, 기능을 하는데 있어서 주요한 부분이 아니라면 별 문제가 없겠지만, 그렇지 않을 경우 정상적인 단백질이 만들어지지 않아 때때로 큰 질환을 야기하게 된다. (그림 1) 실제 존재하는 많은 희귀 유전질환들은 단 하나의 DNA 염기서열이 잘못되어 발생하게 되며, 이로 인해 선천적인 시각장애, 청각장애, 효소결핍으로 인한 대사장애, 조기 사망 등과 같은 치명적인 결과를 낳게 된다.
따라서, 지금까지 많은 연구자들이 30억 쌍에 달하는 인간 DNA 에서 특정 유전자 서열을 특이적으로 바꾸고자 노력해 왔다. DNA의 염기서열을 원하는 대로 바꾸거나 교정할 수 있는 기술은 생명체의 근원을 조절할 수 있는 강력한 도구이다. 이는 기초연구 차원에서 특정 유전자의 기능과 작동원리를 파악하는데 필수적인 기술일 뿐 아니라, 인간의 유전자 이상으로 생긴 질환들을 극복할 수 있는 획기적인 기술로 생각된다. 또한 식물이나 동물의 품종을 개량하거나, 기후변화 등과 같은 위기 극복을 위해 바이오산업계에서도 꼭 필요한 기술이라 할 수 있다. 이에 지난 2012년 말 크리스퍼 유전자가위가 처음으로 개발되었고, 개발된지 만 7여년 만에 매우 빠르게 노벨화학상이 2020년 이 분야에 수여되었다. 바야흐로 유전자 교정 시대가 열린 것이다.
그림 1. 분자생물학의 중심이론(central dogma)와 유전자 교정의 필요성
그림 2. 자연계에 존재하는 제한효소와 인공적으로 개발된 1세대, 2세대 유전자가위 기술들
본 론
1. 제한효소와 유전자가위 기술의 등장
1960~70년대를 거치며 DNA와 관련된 여러가지 효소들이 발견되고, DNA 염기서열을 증폭하거나 읽는 시퀸싱과 같은 기술들이 개발되면서 유전공학, 생명공학 분야가 꽃을 피우게 되었다. 특히, 박테리아와 같은 미생물에서 제한효소(restriction enzyme)가 특정 DNA 서열을 인식하여 절단한다는 사실이 밝혀졌다 (그림 2).
당시 이러한 기술들을 활용하여, 일찍이 1970년대에 제한효소를 활용하여, 크기가 작은 플라스미드 DNA (수십 kbp)수준에서 특정 위치의 DNA를 절단하거나고, 새로운 유전자를 이어붙이는 DNA클로닝 혹은 유전자재조합기술 등이 이어붙여 최초의 유전자 에디팅이 이루어졌다. 이는 유전자 편집 기술의 시작점이라 할 수 있다. 이를 통해 인간의 유전자를 박테리아에 이식하여 ‘인슐린’과 같은 효소나 다양한 단백질들을 만들어 낼 수 있었다. 하지만, 당시의 이 기술들을 곧바로 인간세포와 같은 고등세포에 적용하지는 못하였다. 제한효소는 보통 6~8개의 짧은 염기서열을 인식하기 때문에, 작은 플라스미이드에서는 특이적으로 특정 타겟만을 절단할 수 있다. 특정 위치를 타겟할 수 있었지만, 30억 쌍에 달하는 인간 DNA에서는 한 위치를 타겟하지는 못하였다. 6~8개의 짧은 염기서열만으로는 특정 한 군데만 타겟하지 못하고, 즉, 인간세포에 제한효소를 넣게 되면, DNA의 수천, 수만 위치가 동시에 타겟되어 절단될 위험이 있는 것이다.
유전자 교정 기술의 핵심은 원하는 유전자 부분을 정확히 인식해서 그 부분의 DNA의 결합을 끊어내는 것에 있다. 제한효소는 자연적으로 이러한 기능을 가지고 있는 단백질이다. 그러나 인간 유전체처럼 DNA의 양이 많은 경우에는 제한효소가 가진 인식 범위가 유전체 내부에 수십 군데 존재하기 때문에 오작동의 확률이 너무나 높고, 이 인식 범위는 매우 한정되어 있다.
이후, 연구자들은 타겟 DNA를 인식하는 길이가 짧다는 이러한 제한효소의 한계를 극복하여, 충분히 긴 DNA 염기서열을 인식하면서도, 타겟할 수 있는 타겟 DNA를 마음대로 바꿀 수 있도록 설계된 인공적인 제한효소 즉, 유전자가위를 개발하고자 노력하였다. 1세대 유전자가위로 구분되는 징크핑거핵산분해효소 유전자가위(Zinc Finger Nuclease; ZFN)는 1996년에 처음으로 만들어졌는데, 이를 활용하여 2003년에 실제 초파리의 유전자를 편집 하는데 성공하였다. 이후 보다 정교한 2세대 유전자가위인 탈렌(Transcription-activator-like Effector Nuclease; TALEN)이 2010년에 비슷한 작동원리로 만들어졌다. 이들은 모두 특정 DNA를 인식하여 결합할 수 있는 단백질과 핵산분해효소를 연결하여 표적 유전자를 자르는 기술이다 (그림2). 이 기술들은 DNA를 인식하는 단백질 모듈의 구성을 바꿈으로써 특정 유전자를 표적할 수 있다. 하지만, 단백질 모듈의 구성을 바꾸는 데 들이는 비용이 크고 많은 노력과 시간을 필요로 한다는 단점들이 있어 널리 사용되지는 못하였다. 이후, 이들 유전자가위는 만들기가 어렵고, 상대적으로 가격이 비싸서 많은 연구실에서 사용되지는 못하였다. 한편, 2012년 말~2013년 초에 등장한 3세대 유전자가위인 크리스퍼 기술은 기존의 도구들에 비해 사용하기가 매우 쉬우면서도 정교하고, 가격도 저렴하여 누구나 쉽게 사용할 수 있게 되었다. 비로소 유전자가위 기술이 대중화된 것이라 할 수 있다.
2. 크리스퍼 유전자가위 기술 개발
크리스퍼 시스템은 원래 자연계의 미생물에 존재하는 것으로, 이를 탐구하는 미생물학자들에게는 흥미로운 미지의 영역이었다. 많은 연구진들의 노력에 의해 절반에 가까운 많은 미생물들은 자신의 유전체 내에 반복된 서열들의 집합체인 크리스퍼 지역을 가지고 있다는 것이 2010년대에 밝혀졌다.(그림 3) 미생물들은 이 특징적인 영역 안에 자신을 공격했던 바이러스의 유전정보 중 일부를 기록해 두는 데, 이는 일종의 기억장치라 할 수 있다. 나중에 같은 바이러스가 다시 침입하게 된다면, 저장되어 있던 바이러스 유전정보는 전사되어 가이드 RNA 역할을 하게 된다. 그리고 크리스퍼 영역에 있는 카스 단백질들은 가이드 RNA와 결합하여 이와 상보적인 서열을 가진 바이러스의 DNA를 표적하여 절단하게 된다. 즉, 미생물들은 기억해둔 정보를 바탕으로 바이러스가 재차 침입을 해온다면, 크리스퍼 시스템을 발동시켜 제거할 수 있는 것이다. 이와 같이, 미생물 학자들이 미생물의 후천적 면역 체계인 크리스퍼 시스템을 밝혀낸 순간, 이를 활용한 크리스퍼 유전자가위는 유전자교정의 새로운 패러다임으로 급부상하였다.
여기에서 주목할 만한 점은 크리스퍼 유전자가위는 DNA 타겟을 바꾸는 것이 매우 용이하다는 점이다. 이 시스템을 이용하면 누구나 표적하고 싶은 유전자의 상보적인 가이드 RNA를 합성하여 손쉽게 표적 유전자를 절단할 수 있다 (그림 3, ④응용). 실제로 크리스퍼 유전자가위를 활용하여, 인간 뿐 아니라, 동물, 식물, 미생물 등 지구상에 존재하는 대부분의 생명체에서 손쉽게 높은 효율로 유전자 편집을 유도할 수 있었다.
그림 3. 미생물의 면역체계에서 유래한 크리스퍼 유전자가위
3. 인간세포 내에서의 유전자 편집과 피할 수 없는 문제점 대두
유전자가위는 기본적으로 세포 내의 특정 DNA 염기서열을 인식하여 이중나선절단(Double strand breaks; DSBs)을 일으키는 것을 목표로 한다. 이렇게 절단된 DNA 가닥은 세포 내의 DNA 수선 기작에 의해 복구되는데, 이 과정에서 유전자 편집이 확률적으로 이루어지게 된다. 인간과 같은 고등세포에서는 대표적으로 비상동말단부착(nonhomologous end joining; NHEJ)과 동형방식수선(homology directed repair; HDR) 등을 통해 DNA가 복구된다. 비상동말단부착 기작은 높은 확률(>50%)로 일어나는데, 이 과정에서 일부 DNA 손실이 발생하기 때문에 이를 활용하여 특정 유전자를 손쉽게 망가뜨릴 수 있다. 반면, 동형방식수선 기작은 주변에 동형유전자를 주형으로 해서 수선하기 때문에 아주 정확하게 특정 서열을 교정할 수 있다는 특징이 있는데, 보통 교정 효율이 매우 낮다(<5%) (그림 4).
하지만, 2018년 이후, 크리스퍼 유전자가위에 의한 이중 나선절단으로 인해 세포 내에서는 유전체 대량 손실이나 세포 사멸과 같은 예기치 못한 문제점들이 발생한다는 것이 여러 연구진들에 의해 보고되었다 (그림 4). 이는 유전자가위가 표적 이외의 곳에서 유전자 편집을 유도하는 ‘표적 이탈효과(off-target effect)’와는 다른 차원의 문제로, 원하는 유전자를 타겟했음에도 피할 수 없는 근본적인 한계라 할 수 있다. 이를 극복하기 위해서는 DNA 이중나선 절단을 유도하지 않으면서 특정 유전자를 교정할 수 있는 기술이 필요하다. 크리스퍼 유전자가위가 처음 개발되어 유전자 편집이 보편화되면서 매우 빠르게 이 분야에 노벨 화학상이 수여되었지만, 유전자 교정 연구는 이제 본격적으로 시작되었다고 할 수 있다.
그림 4. 크리스퍼 유전자가위에 의한 이중나선절단 후, 세포에서 발생하는 일들
4. 계속 진화되고 있는 유전자가위 기술들 - 염기교정과 프라임교정
이후, 가이드 RNA만 새롭게 합성해주면 타겟을 쉽게 바꿀 수 있다는 크리스퍼 유전자가위의 장점을 유지하면서 타겟 DNA 이중나선절단을 일으키지 않고 유전자를 교정할 수 있는 기술들이 개발되었다. 대표적인 기술들로 염기교정과 프라임교정을 꼽을 수 있다. 이 도구들은 모두 하버드대학의 데이비드 리우 그룹에서 개발되어 전세계 많은 연구실에서 사용되고 있다. 염기교정 유전자가위는 이중나선절단을 일으키지 않도록 부분적으로 개량된 카스 단백질에 탈아미노화 효소를 부착하여 만들어졌다. 염기교정 기술을 이용하면, 표적 유전자에 있는 특정 염기서열에 작용하여, 염기를 치환시킬 수 있다. 즉, 타겟 유전자의 사이토신(C)이나 특정 아데닌(A)에 있는 아민기를 제거함으로써, 각각 티민(T)이나 구아닌(G)으로 바꿀 수 있다(그림 5). 염기교정 유전자가위는 특정 질병을 일으키는 단일염기변이(single nucleotide variation; SNV)를 정밀하게 교정할 수 있고, 시작 코돈이나 종결 코돈을 교정해서 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 혹은 스플라이싱이 일어나는 염기서열을 치환하여 선택적 스플라이싱을 일으켜서 질병을 치료하는 데에 사용할 수 있다. 이중나선절단을 일으키지 않으면서 크리스퍼 유전자가위의 높은 효율은 여전히 보이고 있기 때문에 염기교정 유전자가위는 특히 유전자 치료 목적으로 널리 각광받고 있다.
한편, 염기교정 유전자가위의 경우, 사이토신(C)을 아데닌(A)으로 치환시킨다던가 염기서열들을 제거하거나 삽입하는 것은 어렵다는 근본적인 한계점이 존재한다. 이러한 단점들을 해결함으로써 최근에 더욱 각광받고 있는 기술은 이 프라임교정 유전자가위이다. 프라임교정 기술은 부분적으로 활성을 잃은 카스 단백질에는 역전사 효소를 연결하여 만들어졌다. 이 경우, 기존 가이드 RNA에 추가 서열을 붙인 프라임교정 가이드 RNA가 이용되는데, 이 추가 서열을 주형으로 역전사 효소에 의해 새로운 DNA가 실시간으로 합성된다. 결과적으로 새롭게 합성된 DNA를 바탕으로 타겟 DNA가 교체되는 방식으로 유전자 교정이 이루어진다 (그림6).
지금까지 서술한 바와 같이, 타겟 유전자를 정확하게 교정하기 위해서는 i) 크리스퍼 유전자 가위를 이용한 동형방식수선, ii) 염기교정 유전자가위, iii) 프라임교정 유전자가위 등을 이용할 수 있다. 동형방식수선을 통한 유전자 교정은 아무런 제약없이 거의 모든 형태의 교정이 가능하다는 장점이 있지만, 타겟 DNA 이중나선절단으로 인한 파생문제들을 가지고 있고 낮은 유전자 교정 효율과 분열되지 않는 세포에 적용하기 어렵다는 한계점이 존재한다. 염기교정 기술은 타겟 DNA 이중나선절단 없이 매우 높은 효율로 염기를 치환시키는 장점이 있으나, 염기치환 외의 교정은 불가능하다는 한계점이 존재한다. 이에 비해 프라임교정 기술은 모든 종류의 유전자 교정을 비교적 높은 효율로 유도할 수 있다는 큰 장점이 있다. 다만, 현재까지는 유전자 교정 길이에 한계점이 있어 수백 bp이상을 교정하는 것은 어렵다.
그림 5. 염기교정 유전자가위 구성(좌)과 염기 치환 원리(우)
그림 6. 프라임교정 유전자가위의 구성(좌)과 선행 기술들과의 유전자 교정 방식과의 비교(우)
결 론
자연계에 존재하는 크리스퍼 면역 시스템을 기반으로 개발된 크리스퍼 유전자가위 기술은 정확하고 정교하고 효율이 높으면서도 저렴하여 손쉽게 유전자 교정을 가능하게 해주는 기술이다. 지구 상의 생명체의 DNA 분자구조는 모두 동일하게 보존되어 있기 때문에, 크리스퍼 유전자가위 기술을 활용하면 인간, 식물, 동물을 포함하여 대부분의 종에서 유전자 편집을 유도할 수 있다. 특히, 사람의 유전자 기능을 밝히는 연구를 하거나, 선천적으로 유전자의 변이를 가지고 태어난 환자를 치료하는데 이 기술을 활용할 수 있다. 크리스퍼 유전자가위를 이용해서 질병의 원인이 되는 모델을 그대로 모사함으로써 질병에 대한 연구를 심층적으로 진행할 수도 있다. 또한, 유전자 편집 스크리닝 기법을 통해서 특정 분자기전과 생체 메커니즘을 밝힘으로써 기본 생화학의 발전에 이바지할 수도 있다.
그러나 현재의 크리스퍼 유전자가위 기술은 완벽하지 않고, 기존의 단점들을 보완하기 위한 노력들이 계속되고 있다. 크리스퍼 유전자가위를 기반으로 염기교정, 프라임교정 기술이 개발되었지만, 현재는 보다 더 정교하고 효율이 높은 유전자가위를 개발하는 연구가 진행중이다. 특히, 아직 수 kb 크기의 유전자를 타겟 위치에 통째로 삽입할 수 있는 거대 유전자 삽입 기술이 개발되어 있지 않기에 여러 선두그룹들에서 앞다투어 개발을 진행하고 있다. 한편으로, 유전자 교정 기술 자체이 갖추어졌다 하더라도 환자의 유전자 교정 치료를 위해서는 생체 내에 안전하고 효과적으로 전달하는 기술 개발 또한 필수적이다(그림7).
바야흐로 ‘바이오 르네상스’ 시대가 열리고 있다. 이는 비단 새로운 유전자 교정 기술만을 의미하는 것은 아니다. mRNA 기술을 이용한 혁신적 백신 개발, 유전자 진단 기술의 혁신적 개발, 새로운 면역항암치료제 개발, 인공장기 개발 등 다양한 분야에서 기존에 상상할 수 없었던 혁신적 기술들이 연구되고 있다. 앞으로 국내 연구진들이 새로운 기술 개발에 크게 기여하기를 희망한다.
그림 7. 유전자 교정 기술의 미래 전망
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정유경 (You Kyeong Jeong)
한양대학교 화학과, 학사 (2013.03 – 2017.02, 지도교수: 배상수)
한양대학교 화학과, 석·박통합 (2017.03 – 2022.08, 지도교수: 배상수, 이준석)
서울대학교 의과대학 유전체의학연구소 연구원 (2022.09 – 현재, 지도교수: 배상수)
배상수 (Sangsu Bae)
서울대학교 물리학부, 학사 (1998.03 – 2005.08, 지도교수: 김선기)
서울대학교 물리천문학부, 석사 (2006.03 – 2008.02, 지도교수: 홍성철)
서울대학교 물리천문학부, 박사 (2008.03 – 2012.08, 지도교수: 홍성철)
서울대학교 화학부, 연수연구원 (2012.09 – 2015.02, 지도교수: 김진수)
한양대학교 화학과, 조교수/부교수 (2015.03 – 2022.02)
서울대학교 의과대학, 부교수 (2022.03 – 현재)
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